Скачать с ютуб ПЦР REAL TIME ОТ и ДО понятными словами. Рекомендации к анализу. Выделяю ДНК Боррелии из клеща! в хорошем качестве

ПЦР REAL TIME ОТ и ДО понятными словами. Рекомендации к анализу. Выделяю ДНК Боррелии из клеща!

ПЦР переводится как полимеразная цепная реакция. Это прямой метод исследования, что означает, что мы ищем непосредственно патоген непосредственно там, где он обитает. Как и в случае с бактериологическим посевом. Это означает, что взяв материал на исследование не оттуда, откуда надо, мы не найдем патоген, даже если в организме он присутствует. При непрямом методе исследования, кстати, ищется нечто, указывающее на наличие патогена в организме, к примеру, антитела. Например к той же самой боррелии - если к ней есть антитела, то человек, скорее всего, заражен. Итак, боррелию методом ПЦР мы ищем либо в клеще, а именно в его желудочно-кишечном тракте, либо в крови пациента. Но так как метод прямой, а его чувствительность начинается от 1000 бактерий в 1 миллилитре, то шанс не обнаружить боррелию в крови методом ПЦР довольно велик, поэтому врач обычно назначает сдачу антител к боррелии. Сам метод полимеразной цепной реакции основан на механизме внутриклеточного удвоения ДНК с помощью определенного фермента - ДНК-полимеразы, потому и полимеразная. Представьте, что у нас есть суп из разной ДНК, которая содержится в клеще. Клещ будет фигурировать везде как пример, во всех других случаях происходит точно также. В супе из клеща присутствует ДНК клеща, ДНК человека, если клещ пил кровь, ДНК различных микроорганизмов и вирусов, которые были частью жизни клеща. Так вот во всем этом супе нам надо найти именно ДНК боррелии. Для этого научно-коммерческие лаборатории нашли участки ДНК боррелии, которые сугубо индивидуальны именно для нее и больше ни для чего. Обычно, они представляют собой отрезки, спаянные каждый в кольцо, где есть флюорофор и его гаситель. Таким образом, в исходном состоянии такой зонд не излучает свечения. на первом этапе полимеразной цепной реакции нам нужно разделить все двухцепочечные ДНК в имеющемся "супе". Этот процесс называется денатурацией. После денатурации наш суп полон одноцепочечных молекул. Мы снижаем температуру до той, при которой будет работать наш единственный фермент - термоустойчивая ДНК-полимераза. После снижения температуры ДНК в супе стремится собраться обратно по закону комплиментароности. Вот тут то и вступают в игру искуственные зонды. При наличии в супе участков, комплиментарных зонду, то есть принадлежащих боррелии, зонды разворачиваются и прикрепляются к таким участкам. Эта фаза называется отжигом. При дальнейшем повышении температуры работает фермент ДНК полимераза, собирая зонды на местах их присоединения еще на пару десятков тысяч азотистых оснований. Таким образом, на первом цикле у нас уже стало в 2 раза больше искомой ДНК чем было в начале. Эта стадия называется элонгацией. Присоединенный развернутый зонд лишается гасителя флюорисценции из-за своего разворачивания и начинает испускать свет. Высокоточный оптический сенсор аппарата регистрирует интенсивность свечения в конце каждого цикла. Цикл повторяют от 40 раз, каждый цикл количество искомой ДНК возрастает в геометрической прогрессии, за это реакция называется цепной. В конце реакции мы видим четкие графики нарастания флюорисценции, что говорит нам о наличии искомой бактерии или вируса. Если флюорисценции не наблюдается, мы получаем отрицательный результат. Итак, вы сдали биоматериал по всем правилам. В данном случае - клещ. Если вы пришли снимать его к квалифицированному персоналу - они сделают все сами. Если же вы вытаскиваете его сами, то положите его в какую-нибудь небольшую баночку. Он приходит ко мне и я готовлю из него суп. После жестокой казни клещ подвергается не только механической обвалке, но и молекулярной. Мы начинаем процесс выделения ДНК из клеща. Клещевой суп наливается в лизирующий раствор и ставится в термостат на 65 градусов на 15 минут. За это время соли уничтожат оболочки клеток клеща и бактерий, что позволит их содержимому вылиться в окружающий бульон. После этого я добавляю раствор для преципитации, который свяжет освободившиеся нуклеиновые кислоты в осадок. В ультрацентрифуге на 14000 оборотов в минуту они пробудут 15 минут, осадок сконцентрируется внизу пробирки. После этого с помощью медицинского отсасывателя надо удалить всякий шлак, оставляя осадок. Теперь осадок и пробирку надо отмыть, чтобы ничего не помешало нашей ДНК-полимеразе работать. В этих наборах две отмывки. Спиртовая и ацетоновая. После каждый отмывки я удаляю всю жидкость, не задевая осадка. После последней промывки нужно, чтобы весь ацетон был удален, по этому сушу осадок при 65 градусах 5 минут. После этого наливаю специальный растворитель осадка, чтобы у меня образовался чистейший молекулярный супчик. Этот супчик и будет подвергнут дальнейшей полимеразной цепной реакции.